Los efectos del NMDAR co - Titular de Guangzhou Co., Ltd.

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 13383 (2023) Citar este artículo

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El receptor de glutamato tipo N-metil-d-aspartato (NMDAR) es un detector de coincidencias moleculares que convierte patrones correlacionados de actividad neuronal en señales para el refinamiento estructural y funcional de los circuitos en desarrollo en el cerebro. La d-serina es un coagonista endógeno del NMDAR. Investigamos los efectos de una potente mejora de las corrientes mediadas por NMDAR mediante la administración crónica de niveles saturados de d-serina en el circuito retinotectal de Xenopus en desarrollo. La exposición crónica al coagonista de NMDAR, d-serina, provocó cambios estructurales y funcionales en el techo óptico. En las neuronas tectales inmaduras, la administración de d-serina condujo a cenadores dendríticos tectales más compactos y menos dinámicos, y a un aumento de la densidad de sinapsis. Las imágenes de calcio para examinar la retinotopía de las neuronas tectales revelaron que los animales criados en d-serina tenían campos receptivos visuales más compactos. Estos hallazgos proporcionan información sobre cómo la disponibilidad de coagonistas endógenos de NMDAR como la d-serina en las sinapsis glutamatérgicas puede regular el refinamiento de los circuitos en el cerebro en desarrollo.

Durante el desarrollo de los circuitos funcionales, los procesos neuronales elaboran y establecen mapas topográficos aproximados, luego se someten a un refinamiento sináptico y estructural para permitir una conectividad precisa1. El receptor de glutamato tipo N-metil-d-aspartato (NMDAR) parece desempeñar un papel evolutivamente conservado en la selección de entradas para el refinamiento dependiente de la actividad2. Si bien los NMDAR son heterogéneos en su composición, clásicamente requieren la unión simultánea del ligando de glutamato y un coagonista, ya sea glicina o d-serina3, junto con una despolarización suficiente para aliviar el bloqueo de magnesio del poro del canal iónico4,5. Los requisitos simultáneos de unión de ligando y despolarización de membrana para la conductancia del canal hacen que los NMDAR sean ideales para la detección de la correlación temporal de entradas convergentes6.

Esto sugiere un modelo mediante el cual la activación de NMDAR puede convertir la actividad neuronal modelada en cascadas de señalización que dirigen el refinamiento de los mapas topográficos. Se ha demostrado que la actividad correlacionada media el fortalecimiento sináptico y promueve la estabilización del eje del axón, prolongando la vida útil de las ramas y suprimiendo la dinámica de las ramas7,8,9. Por el contrario, la actividad no correlacionada promueve la desestabilización de las ramas axonales, incluido un aumento de la adición, pérdida y elongación de ramas10. En varios modelos, la pérdida de la función NMDAR perturba el crecimiento del árbol y la dinámica de los axones y las dendritas, lo que lleva a la desorganización de las proyecciones aferentes durante el desarrollo de mapas topográficos11,12,13,14,15,16,17,18,19. 20,21,22.

La d-serina se encuentra endógenamente en el cerebro en una distribución similar a la de los NMDAR23,24 y mejora la transmisión sináptica dependiente de NMDAR25,26,27. La d-serina ha sido implicada en la potenciación a largo plazo del hipocampo27,28,29,30 y en la depresión31,32,33, así como en aspectos del aprendizaje y la memoria34,35. En el sistema nervioso, sigue siendo controvertido si la glía o las neuronas son la fuente principal de liberación de d-serina36,37,38 y probablemente depende de la región del cerebro, la etapa de desarrollo y la presencia de patología39,40.

El papel de los NMDAR en la plasticidad del desarrollo se ha caracterizado en gran medida mediante manipulaciones de pérdida de función1,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22 ,41,42, que pueden carecer de especificidad si interrumpen la actividad normal de la red al reducir la excitación neuronal general. Por el contrario, la administración de d-serina ofrece una manipulación farmacológica que mejora las corrientes NMDAR existentes al tiempo que preserva el requisito de liberación de glutamato43. Por lo tanto, utilizamos la administración de d-serina como manipulación de ganancia de función para estudiar los efectos de la mejora de la señal específica de NMDAR en el desarrollo del circuito.

En condiciones fisiológicas, la función NMDAR está modulada por la disponibilidad del coagonista43,44. El bloqueo farmacológico del sitio de unión del coagonista da como resultado una pérdida total de la conductancia NMDAR, lo que limita el valor de dichos experimentos para comprender las contribuciones de la d-serina endógena al desarrollo del circuito. La exposición crónica a cantidades saturantes de d-serina evita la regulación endógena de la disponibilidad de coagonistas. Anteriormente demostramos que la administración exógena de d-serina promueve la maduración funcional de las sinapsis glutamatérgicas a través del tráfico del receptor de glutamato tipo ácido α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolpropiónico (AMPAR) y estabiliza la estructura del árbol axonal en el renacuajo de Xenopus. sistema visual43. Sin embargo, este estudio no abordó los efectos de la crianza de d-serina en el desarrollo sobre la remodelación dendrítica postsináptica, la sinaptogénesis y el ajuste de las respuestas visuales. Aquí, utilizamos la administración crónica y saturante de d-serina para examinar la estructura y función de las neuronas postsinápticas en el techo óptico. Descubrimos que la administración de d-serina condujo a una morfología del árbol dendrítico más compacto y estable específicamente en neuronas tectales inmaduras, aumentó la densidad de sinapsis y resultó en campos receptivos visuales más nítidos en el tectum óptico.

El estudio fue aprobado por el Comité de Cuidado Animal del Instituto Neurológico de Montreal de la Universidad McGill. Todos los procedimientos se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices del Consejo Canadiense de Cuidado de Animales.

Para la generación de renacuajos, se prepararon ranas hembras adultas albinas Xenopus laevis (RRID: XEP_Xla300) de nuestra colonia de cría interna con 50 UI de gonadotropina sérica de yegua preñada (PMSG; Prospec Bio HOR-272). Después de 3 días, a estas ranas hembra se les inyectaron 400 UI de gonadotropina coriónica humana (hCG; Sigma-Aldrich CG10; RRID:SCR_018232).

A los machos se les inyectaron 150 UI de hCG el mismo día que las hembras y se colocaron juntos para inducir amplexo. Los huevos se recogieron al día siguiente.

Se recolectaron óvulos de hembras preparadas para fertilización in vitro con esperma de ranas albinas macho. La microinyección de GCaMP6s y ácido ribonucleico mensajero (ARNm) de mCherry en un blastómero de embriones en etapa de dos células se realizó como se describió anteriormente1,21. Brevemente, se inyectó a presión una mezcla de ARNm de GCaMP6 purificado (500 pg) y mCherry (250 pg) en 2 nl de agua libre de RNasa en un blastómero de embriones en etapa de dos células utilizando una micropipeta de vidrio calibrada unida a un picoinyector PLI-100 ( Aparato de Harvard). Varios días después de la inyección, buscamos animales con expresión de mCherry restringida hemilateralmente y altos niveles de fluorescencia de GCaMP6s para su uso en experimentos de imágenes de calcio. Dado que los axones de las células ganglionares de la retina (CGR) se proyectan contralateralmente al tectum óptico, los GCaMP6 marcan las terminales de los axones de las CGR y las células tectales postsinápticas en hemisferios opuestos de estos animales, lo que nos permite realizar imágenes de calcio de las CGR o de las células tectales en cada lóbulo tectal.

Para todos los experimentos, los renacuajos se criaron en recipientes de vidrio mantenidos en incubadoras con demanda biológica de oxígeno a 21 °C con un ciclo de luz:oscuridad de 12 h:12 h. El medio de cría fue solución de Barth modificada 0,1X con HEPES (MBSH; NaCl 88 mM, KCl 1 mM, NaHCO3 2,4 mM, MgSO4 0,82 mM × 7H2O, Ca(NO3)2 0,33 mM × 4H2O, CaCl2 0,41 mM, HEPES 10 mM, pH 7.4).

pCAG-Cre, pCALNL-EGFP, pCALNL-DsRed son un generoso obsequio de CL Cepko y actualmente están disponibles a través de Addgene (plásmidos 13775, 13770, 13769). Todos los plásmidos se cultivaron en células competentes DH5a (Life Technologies) y se purificaron utilizando kits maxiprep libres de endotoxinas (Qiagen)45.

Para sintetizar el ARNm para inyecciones de blastómeros, se clonaron GCaMP6s (plásmido Addgene 40753) y mCherry (plásmido donado por K. Murai) en el vector pCS2+. El plásmido GCaMP6s se cortó con NotI/Klenow fill in/BglII, el plásmido mCherry se cortó con BamHI/EcoRV y el vector pCS2+ se cortó con BamH1/SnaB1. Para la síntesis de ARNm, los plásmidos se linealizaron con NotI y se transcribieron ARNm protegidos de GCaMP6s y mCherry con el kit SP6 mMessage mMachine (Ambion, Thermo Fisher).

Los renacuajos en las etapas 42 a 44 se anestesiaron en MS222 (0,02% en MBSH al 0,1%) y se colocaron en un Kimwipe bajo un microscopio de disección. Se realizó un marcaje unicelular mediado por Cre mediante electroporación (CREMSCLE) para un marcaje escaso y de alta eficiencia del tectum óptico41. Para las imágenes diarias (Fig. 1), se inyectaron intraventricularmente Cre-recombinasa y EGFP dependiente de Cre en una proporción de 1:4000 (2,5 × 10–4 µg/µL pCAG-Cre, 1 µg/µL pCALNL-EGFP) junto con Tinte verde rápido para visualización. Para contar las sinapsis por célula (Fig. 3C, D), coelectroporamos Cre-recombinasa y dsRed dependiente de Cre en una proporción de 1:4000 (2,5 × 10–4 µg/µL pCAG-Cre, 1 µg/µL pCALNL -dsRed) y pPSD95-GFP (1 µg/µL). Inmediatamente después de las inyecciones intraventriculares de los plásmidos, se colocaron en cada lado del cerebro un par de electrodos de placa de platino hechos a medida, conectados a un estimulador eléctrico (SD 9, Grass Instruments), para administrar pulsos de corriente: 38 V, 1,6– 3 ms, 2 pulsos con polaridad inversa separados por 1 s. Se conectó un condensador de 3 µF en paralelo para generar un pulso de corriente de caída exponencial.

Si bien CREMSCLE se utilizó para apuntar a neuronas más pequeñas e inmaduras, utilizamos electroporación unicelular yuxtacelular46 para estudiar las morfologías de una gama más amplia de células tectales. Se introdujo suavemente una micropipeta de vidrio de borosilicato (Sutter Instruments) que contenía el plásmido (1 µg/µL de EGFP) en el cerebro de renacuajos anestesiados en etapa 44–45. Se aplicó un tren de 50 V de pulsos de 1 ms a 200 Hz durante 0,5 s a través de la micropipeta, repitiéndose los trenes de pulsos dos veces para aumentar la entrega del plásmido.

Utilizamos el protocolo experimental para la administración de d-serina publicado anteriormente43. 48 h después de la electroporación (etapa 46-47), los animales fueron examinados en busca de células tectales bien separadas y marcadas con colores brillantes, luego se volvieron a criar en un pocillo aislado que contenía MBSH de control, o MBSH suplementado con d-serina 100 µM (Tocris). , o MBSH con d-serina 100 µM y MK-801 10 µM. Se tomaron imágenes de los animales criados en estos medios durante hasta 3 días como se especifica a continuación.

La luz de excitación a 910 nm (EGFP, GCaMP6s) o 990 nm (dsRed) fue producida por un Mai Tai BB Ti:Sapphire o un láser IR pulsado de femtosegundo InSightX3 (Spectra Physics).

Los animales fueron examinados para detectar una expresión de EGFP escasa y brillante en el techo óptico, se anestesiaron en MS222 (0,02% en 0,1X MBSH), se colocaron en una cámara Sylgard hecha a medida que se ajustaba al cuerpo del renacuajo y se aseguraron debajo de un cubreobjetos. Las imágenes de la serie Z de neuronas tectales individuales se adquirieron diariamente en un microscopio Olympus FV300 modificado para imágenes multifotónicas con un objetivo de inmersión en agua Olympus LUMPLAFLN 60X (1,0 NA). Se recogieron secciones ópticas de la serie Z a intervalos de 1 µm utilizando el software Fluoview (versión 5.0). Después de obtener imágenes, los animales se colocaron individualmente en pocillos de una placa de 6 pocillos en d-serina o medio de cría de control. Se recogieron imágenes todos los días durante 4 días, los animales regresaron a sus respectivos pozos y los medios de cría se cambiaron diariamente. Todas las pilas z de imágenes se eliminaron utilizando el software de eliminación de ruido de medios no locales CANDLE implementado en MATLAB (MathWorks)47, y se realizaron reconstrucciones tridimensionales de neuronas individuales utilizando Imaris 6.0 (Bitplane). Algunas neuronas del grupo de control aparecieron previamente en un artículo de métodos45.

Los animales seleccionados por su expresión brillante y escasa de EGFP en el techo óptico se colocaron en pocillos aislados que contenían d-serina o medio de cría de control. 24 h después, se actualizó el medio de cría y 48 h después de la selección (correspondiente al día 2 de la toma de imágenes diaria, etapa 48), se tomaron imágenes de los animales. Los renacuajos se sumergieron en bromuro de pancuronio 2 mM (Tocris) durante 3 a 5 minutos, se incluyeron en agarosa UltraPure de bajo punto de fusión al 0,8% p/v en una placa de Petri y la placa de Petri se llenó con medio de crianza.

Se tomaron imágenes de los cenadores dendríticos con un objetivo de inmersión en agua Olympus XLUMPlanFLN 20X (1,0 NA) montado en un microscopio multifotónico comercial basado en un escáner de resonancia de alta velocidad (Thorlabs) con enfoque de objetivo piezoeléctrico (Physik Instrumente). Se recogieron secciones ópticas de la serie Z a intervalos de 1 µm utilizando el software ThorImage (versión 3.0+). Después de tomar una imagen inicial (tiempo 0 min), se recogieron imágenes cada 10 min durante 1 h mientras se presentaba al animal una luz de campo completo de 10 ms que destellaba desde un LED de luxeon rojo a 1 Hz. Esta estimulación visual estroboscópica fue controlada por una placa Arduino Uno R3 y un script Matlab personalizado. Todas las pilas z de imágenes se eliminaron con CANDLE, la reconstrucción manual de cuatro dimensiones para el análisis morfométrico dinámico realizada con el software Dynamo implementado en MATLAB48, y analizadas utilizando un script Python personalizado https://github.com/fieryzarzar/morphology_timecourse_analysis.

Siguiendo un procedimiento publicado previamente49, los animales criados en d-serina o medio de cría de control durante 48 h (correspondiente al día 2 de imágenes diarias, etapa 48) se anestesiaron en MS-222 al 0,02% y se fijaron mediante inmersión en paraformaldehído al 4% (Cedarlane/ EMS 15735-30-S) en solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante 1 h a temperatura ambiente, se transfirió a metanol al 100% enfriado con hielo y se fijó posteriormente durante la noche a -20 °C. Luego se lavaron las muestras durante 1 h en una solución de Tris/HCl 100 mM, pH 7,4 con NaCl 100 mM. Para la infiltración y crioprotección, las muestras se incubaron durante la noche a temperatura ambiente en una solución de 15% de gelatina de pescado (Norland HP-03) con 15% de sacarosa, y posteriormente en 25% de gelatina de pescado con 15% de sacarosa. Las muestras se incluyeron y congelaron en una solución de 20% de gelatina de pescado con 15% de sacarosa para crioseccionar. Se recogieron secciones horizontales con un espesor de 20 µm en un criostato y se montaron directamente en portaobjetos Superfrost-plus (Fisher).

Las secciones se procesaron para la recuperación de antígenos con dodecilsulfato de sodio (SDS) al 1% en PBS durante 3 minutos a temperatura ambiente. Los portaobjetos se incubaron con solución de bloqueo (10% de albúmina sérica bovina y 5% de suero de cabra normal en PBS) seguido de anti-GluA1 de conejo (1:200; Abcam ab109450 RRID:AB_10860361) y anti-SV2 de ratón (1:1000; Estudios de desarrollo). Hybridoma Bank sv2-2a RRID:AB_2315387), y marcado con anticuerpos secundarios IgG anti-conejo de cabra Alexa-555 (1:200; Invitrogen A-21428 RRID:AB_141784) e IgG anti-ratón de cabra Alexa-647 (1:200; Invitrogen A21236 RRID:AB_2535805). Se adquirieron imágenes confocales del techo óptico con un objetivo CS2 de 20x/0,75 en un microscopio confocal Leica SP8.

Para la cuantificación de la sinapsis, se utilizó un enfoque publicado previamente49. Brevemente, el análisis se realizó en las secciones ópticas 3 μm debajo de la superficie de corte de la sección histológica en campos desprovistos de exceso de vasculatura o irregularidades de sección. Se seleccionaron campos de 20 μm × 20 μm de la región del neuropilo de cada hemisferio tectal fotografiado. Las imágenes se preprocesaron usando FIJI con resta de fondo (bola rodante de 10 px de radio), luego filtrado medio (radio de 2 px), seguido de umbral automático de Momentos para cada canal. Para identificar las sinapsis, se tomó el AND lógico de los canales SV2 (presinápticos) y GluA1 (postsinápticos), luego se aplicó la función Analizar partículas con el criterio de tamaño de 0,1 a 5,0 μm2 de área para estimar el número de puntos con etiquetado pre y postsináptico. . El análisis se realizó ciego a las condiciones experimentales.

Los animales examinados para detectar una expresión brillante y escasa de dsRed se criaron en d-serina o d-serina más MK-801 o en medio de cría de control durante 48 h (correspondiente al día 2 de imágenes diarias, fotografiadas en la etapa 48). Se tomaron imágenes de animales vivos con la misma configuración que para las imágenes diarias. Se recogieron secciones ópticas de la serie Z a intervalos de 1 µm utilizando el software Fluoview (versión 5.0) para los canales rojo (dsRed) y verde (PSD95-GFP). Todas las pilas z de imágenes se procesaron con el software FIJI utilizando las funciones de filtrado de resta de fondo (bola rodante de 10 µm) y mediana (radio de 2 µm). Las imágenes se hicieron binarias utilizando el umbral automático MaxEntropy y Moments para los canales dsRed y PSD95-GFP, respectivamente. Para identificar sinapsis, se aplicó la función Analizar partículas con un criterio de tamaño de 0,1 a 5,0 μm2 para identificar los puntos sinápticos marcados con PSD95-GFP. El AND lógico de los dos canales que utilizan el canal dsRed como máscara dendrítica, identificó los puntos sinápticos dentro del volumen dendrítico definido. Los somas celulares y los axones se excluyeron del análisis. El análisis se realizó ciego a las condiciones experimentales.

Utilizando un procedimiento publicado previamente1, los animales seleccionados por su expresión brillante de GCaMP6s y mCherry restringida a la mitad lateral de su cuerpo se transfirieron a d-serina o medio de cría de control desde la etapa 37 en adelante y se tomaron imágenes una semana después en la etapa 48, desde la célula ganglionar de la retina ( RGC) los axones llegan al tectum después de la etapa 3750.

Los renacuajos se inmovilizaron mediante inmersión en bromuro de pancuronio 2 mM y se inmovilizaron en agarosa al 1% de bajo punto de fusión en una cámara personalizada con una ventana de cubreobjetos de vidrio en un lado, a través de la cual el animal podía ver los estímulos visuales presentados en una pantalla LCD. El área de la pantalla LCD midió 6,5 cm (ancho) × 4 cm (alto). El renacuajo se colocó de modo que el ojo estuviera a 2,2 cm de la pantalla, alineado con el centro del borde inferior del área de visualización. Desde este punto de vista, el área de visualización abarcaba aproximadamente un ángulo visual de 110° en azimut y 80° en elevación.

Las imágenes de fluorescencia de calcio se capturaron con un microscopio de dos fotones basado en un escáner de resonancia de alta velocidad (Thorlabs) con enfoque piezoeléctrico (Physik Instrumente) de un objetivo Nikon de inmersión en agua de 20 × con apertura numérica de 1,0. Se utilizó una longitud de onda de excitación de 910 nm para los GCaMP6 y la señal de emisión se recopiló a través de un filtro de paso de banda 525/50. Se instaló un filtro Wratten #29 (Kodak) en la pantalla LCD para evitar que la luz de la pantalla interfiera con la señal de calcio. Se utilizaron scripts MATLAB personalizados basados en Psychophysics Toolbox (RRID: SCR_002881)51,52,53 para generar los estímulos visuales y sincronizar la presentación del estímulo con la captura de imágenes. Los estímulos visuales se presentaron de forma monocular y se obtuvieron imágenes de la señal de calcio desde el tectum contralateral al ojo estimulado. Se recogieron imágenes (512 × 512 píxeles, 0,496 µm por píxel) de una única sección óptica a 15 Hz o de tres a cuatro secciones ópticas (con uno o dos fotogramas flyback) a 6 Hz.

El procesamiento y análisis de los datos de imágenes de calcio se realizaron con scripts personalizados en MATLAB (RRID: SCR_001622) y Fiji (RRID: SCR_002285). Para los análisis que comparan dos grabaciones separadas, las imágenes se alinearon utilizando la función de biblioteca imregtform() de MATLAB o el algoritmo NoRMCorre para la corrección de movimiento no rígido54.

Luego se estimó la representación del campo visual en el tectum con un “mapeo de cuadrícula”1. Brevemente, al animal se le presentaron barras oscuras verticales u horizontales de 18° de ancho en 5 posiciones espaciadas equidistantemente a lo largo del azimut o del eje de elevación respectivamente, de forma aleatoria. Para cada píxel, se calculó una "posición de estímulo óptima" en función de la respuesta ΔF/Fo promedio ponderada del píxel a cada posición de estímulo para estimar el centro del campo receptivo del píxel. Las ROI del cuerpo celular se segmentaron automáticamente usando Cellpose55 y las respuestas ∆F/Fo se promediaron dentro de cada ROI. La "nitidez del campo receptivo" se cuantificó como la respuesta promedio ∆F/Fo a las dos posiciones de estímulo más cercanas a la "posición de estímulo óptima" dividida por la respuesta promedio a las posiciones de estímulo restantes en la periferia. Solo se evaluaron los cuerpos celulares con respuesta de estímulo máxima ∆F/Fo > 2 y posiciones de estímulo óptimas entre las tres posiciones de estímulo central. Se excluyeron los cuerpos celulares de menos de 30 píxeles y los animales con menos de 30 cuerpos celulares que cumplieran los criterios de evaluación.

Los análisis se realizaron de acuerdo con las pautas de ARRIVE. Los análisis estadísticos se realizaron en GraphPad Prism 8.0. La normalidad de las distribuciones de datos se confirmó mediante la prueba de Shapiro-Wilk. Los detalles de las pruebas estadísticas de cada experimento se pueden encontrar en las leyendas de las figuras. Toda la cuantificación se representa gráficamente como media ± SEM, a menos que se indique (Información complementaria).

Para visualizar la morfología del árbol dendrítico de las neuronas en el tectum óptico, electroporamos células tectales para expresar escasamente EGFP y luego realizamos imágenes diarias de dos fotones in vivo durante cuatro días. Después de recolectar imágenes basales de microscopio de barrido láser de dos fotones de neuronas tectales marcadas individualmente (día 0, etapa 46-47), los animales se criaron en d-serina 100 μM, que mejora las corrientes retinotectales NMDAR43. Durante los siguientes 3 días (etapa 48), se tomaron imágenes de las células cada 24 h (Fig. 1A, B). Para las neuronas con árboles dendríticos inicialmente menos maduros (< 500 μm de longitud inicial del árbol), pero no aquellas con árboles más grandes (≥ 500 μm), observamos una reducción significativa en la longitud del árbol dendrítico en animales criados con d-serina en comparación con los controles, evidente por a los 2 días (Fig. 1C), pero no hubo diferencias significativas en el número de puntas de ramas dendríticas (Fig. 1D). Por lo tanto, centramos nuestro análisis morfológico en neuronas inmaduras.

CREMSCLE es un método de electroporación masiva para etiquetado disperso basado en la coelectroporación de cre recombinasa de baja concentración y plásmidos EGFP floxed-stop45. Debido a que el plásmido se inyecta en el ventrículo cerebral, marca preferentemente las células inmaduras recientemente diferenciadas cercanas a la zona proliferativa periventricular del tectum. El análisis de Sholl de estas neuronas inicialmente inmaduras reveló que la crianza con d-serina durante 3 días redujo la elaboración del árbol dendrítico lejos del cuerpo celular en comparación con las células de los animales de control (Fig. 1E). En general, las neuronas inmaduras expuestas a la d-serina se desarrollaron para ser más compactas que los controles.

Crecimiento de cenadores dendríticos de células tectales en animales criados en d-serina durante 4 días. (A) Diseño experimental. Los renacuajos en las etapas 42 a 44 se sometieron a electroporación, se examinaron para determinar la expresión de GFP unicelular 48 h después en las etapas 46 a 47, y se tomaron imágenes de las células GFP + diariamente. Después de una imagen de referencia el día 0, los animales se criaron en medio control o d-serina y se recogieron imágenes todos los días durante 3 días más. (B) Proyecciones Z de neuronas tectales representativas. Barra de escala: 20 µm. (C, D) Cuantificación de la longitud (C) y el número (D) de puntas de los árboles dendríticos de renacuajos criados en d-serina (cuadrados rojos) en comparación con el control (círculos negros), subdivididos en inmaduros (longitud total del árbol dendrítico < 500 µm el día 0) o maduro (≥ 500 µm el día 0). Las células inmaduras se marcaron con CREMSCLE y las células maduras mediante electroporación unicelular. Para las células inmaduras, la longitud total del eje dendrítico y el número de puntas de las ramas se redujeron en d-serina en comparación con el control. [Interacción RM ANOVA *p < 0,05, prueba post-hoc de comparaciones múltiples de Šídák Día 2 **p < 0,005, Día 3 *p < 0,05. 1 célula por animal, células inmaduras: n = 6 células para d-serina, n = 9 para control, células maduras: n = 4 células para ambos grupos] (E) El análisis de Sholl de las células CREMSCLE muestra que la arborización dendrítica tectal ocurre más cerca del soma en animales criados en d-serina. [Interacción RM ANOVA con corrección de multiplicidad, día 3 p < 0,0005, prueba post-hoc de Šídák para comparaciones múltiples ****p < 0,0001. 1 célula por animal analizado con n = 9 células para d-serina, n = 6 para control].

Nuestra hipótesis es que estas diferencias morfológicas podrían haber sido el resultado de una estabilización prematura de los ejes dendríticos de neuronas inmaduras en d-serina. Para probar esta idea, se investigó la dinámica de las ramas con imágenes de intervalos cortos cada 10 minutos durante 1 h en animales expuestos a estimulación visual en forma de destellos estroboscópicos de 1 Hz ("estroboscópicos"). Como las imágenes diarias revelaron un impacto significativo en la longitud del árbol a las 48 h de exposición a d-serina (Fig. 1C), a continuación tomamos imágenes de la remodelación dinámica de los árboles dendríticos en renacuajos en etapa 48 que habían sido criados en d-serina durante 48 h (Fig. 2A,B). Los procesos dendríticos se clasificaron como filopodios (< 10 µm de longitud) o ramas (> 10 µm) y se analizaron por separado, ya que se ha demostrado que estos compartimentos dendríticos tienen elementos citoesqueléticos distintos, crecimiento dependiente de la actividad y vínculos con la sinaptogénesis48,56.

Filopodios y dinámica de ramas de cenadores dendríticos de células tectales en animales criados en d-serina durante 48 h. (A) Diseño experimental. Los renacuajos en las etapas 42 a 44 se sometieron a electroporación, se examinaron para determinar la expresión de GFP 48 h después en las etapas 46 a 47 y se criaron en medio control o d-serina durante 48 h hasta la etapa 48. Después de la imagen inicial, se tomaron imágenes de las células cada 10 minutos para Durante 1 hora, los renacuajos fueron estimulados visualmente con destellos estroboscópicos de 1 Hz. (B) Imágenes representativas de árboles dendríticos durante la obtención de imágenes y una imagen final fusionada que superpone los puntos de tiempo 0 (magenta) y 60 (amarillo) min. Barra de escala: 10 µm. (C) Densidad de procesos contados por punto de tiempo para filopodios (procesos dendríticos <10 µm de longitud; sombreados) y ramas (≥ 10 µm de longitud; sin sombrear) de los cenadores de control (negro) y d-serina (rojo). La densidad se calculó como el número de procesos dendríticos dividido por la longitud del eje. (D) Número de filopodios agregados al árbol dendrítico durante 1 h de obtención de imágenes. (E) El número de filopodios perdidos mostró una tendencia hacia una disminución en los árboles de d-serina en comparación con el control. [prueba t #p = 0,06] (F) Longitud de las elongaciones filopodiales y (G) retracciones durante 1 h de obtención de imágenes. (H) Motilidad filopodial (suma de elongaciones y retracciones) por punto temporal. (I – M) Cuantificación de ramas, incluido (I) número agregado y (J) perdido durante 1 h. (K) Las ramas mostraron una tendencia a alargarse menos durante 1 h en los cenadores de d-serina en comparación con el control. [prueba t #p = 0,06] (L) La duración de las retracciones de las ramas durante 1 h fue significativamente menor en el grupo de d-serina [prueba t *p < 0,05], al igual que la motilidad de las ramas (M) por punto temporal [RM ANOVA efecto principal del tratamiento *p < 0,05]. 1 célula por animal analizada con n = 6 para d-serina, n = 7 para control.

La cría de d-serina no pareció cambiar la densidad general de los procesos dendríticos (número de procesos divididos por la longitud del eje), independientemente de si los procesos eran filopodios o ramas (Fig. 2C). El número total de filopodios agregados y perdidos (Fig. 2D, E) y ramas (Fig. 2I, J) no fueron significativamente diferentes entre los cenadores criados con d-serina y los de control, aunque se observó una tendencia hacia menos eventos dinámicos en los criados con d-serina. animales era evidente. También cuantificamos los alargamientos de filopodios y ramas (Fig. 2F, K) y retracciones (Fig. 2G, L) durante la hora, así como su motilidad total por punto temporal (Fig. 2H, M). La cuantificación del crecimiento filopodial no mostró diferencias significativas entre los dos grupos (Fig. 2F, G). Sin embargo, las ramas dendríticas en animales criados con d-serina mostraron una tendencia a alargarse menos (Fig. 2K) y mostraron una retracción significativamente menor (Fig. 2L) durante la hora de toma de imágenes. En general, la exposición a d-serina redujo significativamente la motilidad de las ramas por punto de tiempo durante la hora de obtención de imágenes (Fig. 2M). Estas observaciones de la dinámica del árbol sugieren que las ramas dendríticas expuestas crónicamente a la d-serina tienen una menor tendencia a alargarse y retraerse durante la estimulación visual, lo que lleva a árboles dendríticos que son más estables con el tiempo. En particular, los efectos de la d-serina sobre la estabilización se observan en procesos más maduros (ramas) que tienen más probabilidades de tener sinapsis. Estas observaciones apoyan la hipótesis de que la mejora de la señalización NMDAR conduce a una hiperestabilidad del árbol dendrítico.

Dado que la morfogénesis de las ramas dendríticas se vio afectada por la cría de d-serina, a continuación investigamos si la sinaptogénesis también podría verse afectada. Examinamos los efectos de la d-serina crónica sobre la densidad de sinapsis utilizando el marcaje inmunohistoquímico de marcadores presinápticos (SV2) y postsinápticos (GluA1) en secciones criostáticas del tectum óptico de animales criados en d-serina durante 48 h (desde la etapa 46–47 hasta la etapa 48). La cuantificación de las "sinapsis anatómicas" se basó en la yuxtaposición superpuesta de estos marcadores pre y postsinápticos en imágenes confocales del neuropilo tectal49. Encontramos que la densidad de sinapsis anatómica aumentó significativamente en el neuropilo tectal después de 2 días de exposición a d-serina (Fig. 3A-C).

En conjunto, nuestras observaciones de cenadores dendríticos más compactos y estables y un mayor número de sinapsis en el neuropilo tectal de animales criados con d-serina sugieren que sus dendritas tectales individuales deberían tener una mayor densidad de entradas sinápticas. Por lo tanto, electroporamos células tectales en la etapa 42-44 para expresar la proteína de densidad postsináptica 95 del marcador sináptico fusionada a EGFP (PSD95-GFP) junto con una escasa expresión unicelular de dsRed por CREMSCLE. Luego se criaron animales con un etiquetado adecuado durante 48 h en un medio que contenía d-serina (Fig. 3D). La cuantificación de la densidad del punto de PSD95-GFP en neuronas marcadas con dsRed confirmó que las células criadas con d-serina tenían un número significativamente mayor de puntos sinápticos por volumen dendrítico (Fig. 3E, F). Para excluir la posibilidad de que la d-serina pueda estar actuando a través de receptores no NMDA, como los receptores sinaptogénicos delta de glutamato57,58, algunos animales se criaron en d-serina más el bloqueador del canal NMDAR MK-801 (10 µM). La adición de MK-801 impidió el aumento de la densidad de sinapsis, lo que indica que el efecto observado de la d-serina depende de NMDAR.

Densidad sináptica en el tectum de animales criados en d-serina durante 48 h. (A) Diseño experimental: los renacuajos en la etapa 46–47 se criaron en medio control o d-serina durante 48 h hasta la etapa 48, luego se fijaron, seccionaron y se inmunotiñeron para SV2 y GluA1 para imágenes confocales. (B) Puntos colocados colocalizados de inmunofluorescencia SV2 (presináptica) y GluA1 (postináptica) en secciones del cerebro. Para un campo de muestra, (i) se muestra el neuropilo tectal, (ii) ampliado a una región de interés discontinua de 20 µm × 20 µm (arriba) con procesamiento automatizado para identificar “sinapsis anatómicas” (abajo, superposición blanca, ver "Materiales y métodos"). (C) La densidad de sinapsis anatómica en el tectum óptico se elevó significativamente en los animales criados en d-serina. [prueba t *p < 0,05. Se analizaron de 2 a 3 campos por hemisferio tectal, es decir, al menos 5 campos por animal de n = 5 d-serina, 3 animales de control]. Solo se incluyeron puntos colocalizados que se ajustaban al criterio de tamaño de sinapsis de 0,1 a 5,0 µm2. (D) Diseño experimental: los renacuajos en la etapa 42–44 se sometieron a electroporación, se examinaron para determinar la expresión de dsRed y PSD95-GFP 48 h después en la etapa 46–47, se criaron en medio control, d-serina o d-serina + MK-801 para 48 h y fotografiado en la etapa 48. (E) Árboles dendríticos ampliados de neuronas tectales que expresan puntos PSD95-GFP + (amarillo) en células dsRed + (magenta). Barra de escala: 10 µm. Flechas: ejemplos de puntos sinápticos. (F) La cuantificación de las densidades de puntos PSD-95 por volumen de árbol dendrítico para neuronas tectales individuales revela que la cría en d-serina aumenta la densidad de sinapsis, lo que se evita cuando MK-801 bloquea los NMDAR. [ANOVA unidireccional con prueba post-hoc de Dunnett para comparaciones múltiples **p < 0,01, *p < 0,05. n = 6 control, 10 d-serina, 8 d-serina + células MK-801].

Para investigar cómo la cría de d-serina puede alterar el desarrollo del mapa retinotópico, utilizamos imágenes de calcio con estimulación visual para extraer mapas topográficos funcionales en la tecta óptica de renacuajos criados en d-serina o medios de control (Fig. 4A). Realizamos inyecciones de ARNm en un blastómero en la etapa de desarrollo de dos células para generar renacuajos en mosaico hemilateral que expresan GCaMP6 en un lado del animal, etiquetando así las células tectales pero no los axones RGC que las inervan desde el ojo contralateral. Se tomaron imágenes de los animales en la etapa 48 después de haber sido criados en d-serina desde la etapa 37, cubriendo el período de desarrollo durante el cual los axones de RGC llegan por primera vez para inervar el tectum50. Se registraron respuestas de calcio de dos fotones del tectum óptico mientras se presentaban estímulos de mapeo de campo receptivo.

Para medir las propiedades de respuesta de las neuronas tectales individuales que forman el mapa retinotópico, a los renacuajos se les presentó una barra oscura sobre un fondo brillante que aparecía repetidamente en orden aleatorio en una de las 5 posiciones a lo largo del acimut o los ejes de elevación. Se segmentaron los somas de células individuales a partir de las imágenes de dos fotones y se estimó el centro del campo receptivo para cada cuerpo de célula tectal en función de la fuerza relativa de las respuestas a los estímulos en cada una de las 5 posiciones (mapa de cuadrícula; Fig. 4B, C). .

Cuantificamos la "nitidez del campo receptivo" de las células tectales individuales para estimar el tamaño de su campo receptivo, que previamente se ha demostrado que aumenta con el bloqueo NMDAR1,59. La nitidez del campo receptivo se define como el cambio de fluorescencia promedio de los estímulos presentados en las posiciones de estímulo óptimas, dividido por la respuesta media a la estimulación de las posiciones de estímulo no óptimas restantes, para el acimut (Fig. 4B, D) y la elevación (Fig. 4C,E) ejes. Un valor de nitidez del campo receptivo más alto sugiere un campo receptivo más compacto. En la condición de d-serina, hubo un desplazamiento significativo hacia la derecha en las distribuciones de probabilidad acumulada de la nitidez del campo receptivo, particularmente en el eje de elevación. Por lo tanto, nuestros datos sugieren que la cría de d-serina conduce a campos receptivos visuales más compactos para las neuronas tectales, lo que es consistente con la compactación del árbol y el aumento de la densidad de sinapsis de las dendritas de las células tectales.

Mapas retinotópicos postsinápticos en animales en etapa 48 criados en d-serina desde la etapa 37. (A) Diseño experimental. Se inyectó ARNm para GCaMP6 en un blastómero en la etapa de dos células para generar renacuajos con expresión en mosaico de GCaMP6 restringida a la mitad del animal. Los renacuajos se examinaron en la etapa 37 para determinar la expresión de GCaMP6s, luego se criaron en control o d-serina para obtener imágenes de dos fotones de fluorescencia de calcio en el tectum óptico en la etapa 48. Barra de escala: 50 µm. (B, C) Imágenes representativas que muestran las ubicaciones del centro del campo receptivo (izquierda) y la nitidez del campo receptivo (derecha) de células tectales individuales en respuesta a una barra que destelló en cada una de las 5 ubicaciones a lo largo de los ejes de acimut (B) y elevación (C). Los mapas están codificados por colores según la posición óptima del estímulo que evoca una respuesta en cada célula. Barra de escala: 50 µm. (D, E) Distribuciones de probabilidad acumulada de la nitidez del campo receptivo de los cuerpos celulares tectales en animales individuales (líneas más claras) y agrupados por tratamiento (líneas más oscuras) para el azimut (D) [n = 365 células de 6 animales para d-serina, n = 181 células de 5 animales para control] y (E) ejes de elevación [n = 326 células de 6 animales para d-serina, n = 172 células de 5 animales para control. Prueba de Kolmogorov-Smirnov para valores agrupados *p < 0,05].

Nuestro estudio investigó los efectos de la administración crónica de niveles saturados del coagonista d-serina de NMDAR en el desarrollo morfológico del circuito retinotectal. Observamos que los ejes dendríticos de neuronas inmaduras expuestas a d-serina tenían una morfología más compacta, probablemente debido a una mayor estabilización de los ejes dendríticos, y tenían una mayor densidad de sinapsis. Funcionalmente, las imágenes de calcio revelaron campos receptivos más compactos de neuronas tectales en animales criados en d-serina. En conjunto, estos hallazgos sugieren que en el circuito retinotectal en desarrollo, maximizar la señalización NMDAR dependiente de la actividad a través de niveles saturantes de d-serina conduce a la compresión estructural de los cenadores dendríticos de las células tectales de modo que tomen muestras más extensamente de un conjunto de entradas más agrupadas espacialmente.

Nuestras observaciones morfológicas de una disminución del crecimiento dendrítico en condiciones de mejora de NMDAR mediante la administración de d-serina fueron inicialmente sorprendentes, dados informes anteriores de que el bloqueo de NMDAR con APV in vivo también redujo el crecimiento dendrítico durante 24 h16 y disminuyó el tamaño y la dinámica de las ramas dendríticas durante 2 h de obtención de imágenes17. . Sin embargo, nuestros resultados son consistentes con observaciones en otros sistemas modelo, como en el tálamo visual del hurón, donde el tamaño del eje dendrítico y la densidad de la columna aumentaron en respuesta a una semana de administración de APV14. En el homólogo del tectum de los mamíferos, el colículo superior, el bloqueo de NMDAR conduce a una inervación menos refinada por los axones de RGC13 y a un aumento de los campos receptivos60. En cultivos corticales primarios, la aplicación de los moduladores endógenos negativos de NMDAR quinurenato, sulfato de pregnenolona, espermidina y zinc da como resultado una expansión del árbol dendrítico con ramificaciones más distales61. La administración aguda versus crónica de fármacos puede explicar algunas discrepancias en los efectos observados entre los estudios. Además, diferentes agentes farmacológicos pueden actuar preferentemente sobre distintos compartimentos celulares. Por ejemplo, la eliminación de GluN1 en las células tectales postsinápticas conduce a menos ramas dendríticas en comparación con las células en las que la eliminación de GluN1 está dirigida a sus entradas presinápticas de RGC21.

En el estudio actual, informamos que mejorar la actividad NMDAR con d-serina durante 48 h conduce a una disminución de la elaboración del árbol. Esto está en línea con los hallazgos del sistema somatosensorial de ratones con desactivación de GluN1, donde las células de barril que reciben aferentes de los bigotes del trigémino desarrollan dendritas más largas sin sesgo de orientación19. De manera similar, la eliminación de GluN1 en las neuronas excitadoras corticales da como resultado exuberantes pérgolas dendríticas en células estrelladas espinosas que irradian sin un sesgo claro hacia los centros del barril62. A su vez, estos animales muestran patrones de ramificación alterados de las aferencias de los bigotes19,20. En general, la pérdida de NMDAR funcionales altera los patrones de circuitos en todo el sistema somatosensorial, desde el nivel del tronco encefálico15 hasta la corteza22.

Aquí, encontramos que mejorar la actividad NMDAR con d-serina durante 48 h condujo a árboles dendríticos más compactos y menos dinámicos específicamente en neuronas con árboles inicialmente pequeños e inmaduros. Nuestros resultados que muestran diferencias entre las condiciones de control y d-serina para árboles dendríticos que inicialmente son menos maduros (<500 μm de longitud inicial del árbol), pero no aquellos con árboles más grandes (≥ 500 μm), recuerdan los hallazgos de experimentos anteriores en CaMKIIα. Estos experimentos demostraron que la sobreexpresión de CaMKIIα, un efector clave aguas abajo del NMDAR, también ralentiza el crecimiento dendrítico de neuronas inmaduras, pero no de las más maduras63. Por lo tanto, la actividad NMDAR parece limitar el crecimiento y estabilizar los cenadores de neuronas más inmaduras, quizás actuando como un mediador de la maduración neuronal dependiente de la actividad.

Para comprender mejor cómo la detección de coincidencias mediante NMDAR convierte la actividad neuronal en señales para el refinamiento topográfico, un enfoque ha sido manipular la experiencia visual sensorial para inducir actividad neuronal modelada y estudiar sus efectos en tiempo real9. Específicamente, la estimulación visual estroboscópica se puede utilizar para impulsar fisiológicamente la actividad en el sistema retinotectal64. Bajo estimulación estroboscópica, la señalización NMDAR mejorada en neuronas inmaduras expuestas a d-serina durante 48 h condujo a la estabilización de la dinámica de las ramas dendríticas. Esta disminución de la motilidad de las ramas probablemente explica la morfología del árbol dendrítico más compacto que observamos después de 48 h de exposición a d-serina.

Se cree que la morfología dendrítica está relacionada con las propias sinapsis. El cambio de cenadores pequeños y simples a cenadores más grandes y complejos a medida que la neurona madura corresponde al cambio bien caracterizado de la neurotransmisión glutamatérgica predominantemente mediada por NMDAR, típica de las sinapsis inmaduras, a la neurotransmisión mediada por AMPAR y NMDAR en las sinapsis maduras65,66. Las células con ejes dendríticos más cortos (<200 μm de longitud) tienden a mostrar una relación AMPA/NMDA más baja que las células con ejes más grandes (>200 μm de longitud)16. De hecho, la hipótesis sinaptotrópica de Vaughn propone que la estabilidad de las ramas puede ser conferida por la presencia de una sinapsis estable67,68. Las imágenes en vivo de las sinapsis marcadas con PSD-95 en las neuronas tectales del pez cebra revelaron que eran sitios de estabilización dendrítica a partir de los cuales se producen sucesivas ramificaciones y crecimiento69. Aquí, informamos un aumento de la densidad del punto PSD-95 después de la exposición a d-serina. La observación de que los cenadores de d-serina son más compactos pero exhiben una mayor densidad sináptica, sugiere que las neuronas tectales postsinápticas pueden experimentar una regulación homeostática de la entrada sináptica total.

Elegimos utilizar d-serina en lugar de glicina como coagonista de NMDAR más específico en estos experimentos debido al conocido papel de la glicina como neurotransmisor inhibidor en el sistema retinotectal70. Sin embargo, también se ha informado que la d-serina se une a los receptores de glutamato de tipo delta para promover la sinaptogénesis57,58. Creemos que los efectos del cultivo de d-serina en nuestro estudio estuvieron mediados por los NMDAR, ya que fueron rescatados mediante la adición del bloqueador de poros NMDAR, MK-801 (Fig. 3F). Además, nuestro trabajo anterior ha demostrado una mejora electrofisiológica de las corrientes mediadas por AMPAR sin cambios residuales en las corrientes NMDAR en las neuronas tectales de Xenopus después del lavado del fármaco después de 48 h de cría de d-serina43. En conjunto, estos resultados indican que los efectos de la d-serina en las neuronas tectales probablemente estén mediados por NMDAR, y que la exposición de los renacuajos a niveles saturados de d-serina no conduce a una internalización crónica de NMDAR.

Estos cambios en la morfología relacionados con NMDAR se han relacionado con el desarrollo y mantenimiento de mapas retinotópicos. El bloqueo crónico de NMDAR conduce a una degradación de la convergencia de la proyección de RGC dentro del tectum óptico12 y a la desagregación de las bandas de dominancia ocular en el tecta con doble inervación en anfibios7,71. El bloqueo de NMDAR también conduce a una ampliación funcional de los campos visuales receptivos en el Xenopus tectum1,59. El bloqueo farmacológico crónico de los NMDAR en la corteza visual de gatitos sometidos a privación monocular evitó la pérdida de capacidad de respuesta al ojo privado72. Además, la inhibición crónica de la traducción de GluN1 mediante infusión antisentido durante el desarrollo previene la maduración de la selectividad de orientación en la corteza visual primaria del hurón73. En general, estas líneas de evidencia sugieren que una regulación adecuada de la señalización NMDAR es importante para dirigir con precisión los axones a sus socios dendríticos, fortalecer las sinapsis apropiadas y, en última instancia, para refinar los mapas. Nuestros experimentos, que mejoraron la actividad NMDAR evocada sinápticamente, en lugar de depender del bloqueo o eliminación farmacológica, confirman y amplían las conclusiones de estos estudios sobre la influencia de la actividad NMDAR en la morfogénesis dendrítica.

La actividad NMDAR también juega un papel importante en el ajuste de las propiedades funcionales del circuito. Al examinar las propiedades del campo receptivo tectal utilizando imágenes de calcio, vimos que criar animales en d-serina aumentaba la nitidez del campo receptivo de las neuronas individuales sin alterar la organización del mapa topográfico grueso. Este hallazgo complementa trabajos anteriores en los que los campos receptivos tectales ópticos de Xenopus medidos electrofisiológicamente59 o mediante imágenes de calcio1 se ampliaron como resultado del bloqueo crónico de NMDAR durante el período de refinamiento del campo receptivo. Por lo tanto, sugerimos que, aunque la mejora de NMDAR mediante la exposición a d-serina no logra alterar gravemente la organización topográfica general, establecida en gran medida por señales de guía molecular74,75, modula la plasticidad sináptica y conduce a alteraciones locales en las propiedades de respuesta retinotópica de las neuronas tectales. Curiosamente, se ha demostrado que las entradas no visuales del rombencéfalo se dirigen a las dendritas más proximales y se separan de las entradas visuales mediante un mecanismo dependiente de NMDAR76. Como observamos mediante el análisis de Sholl, que la exposición a d-serina conduce a cenadores más compactos que se elaboran más profundamente en el neuropilo tectal, una investigación adicional podría revelar si la mejora de la señal NMDAR por la d-serina afecta diferencialmente las entradas visuales versus no visuales.

Finalmente, será importante investigar si la d-serina liberada endógenamente actúa como un regulador de la plasticidad del circuito en condiciones tanto fisiológicas como patológicas. Dado que se cree que la síntesis y liberación de d-serina está regulada en conjunto por neuronas77 y glía, particularmente astrocitos39, esto sugiere un mecanismo de metaplasticidad en el que la disponibilidad de d-serina regulada por astrocitos en las sinapsis glutamatérgicas modula la plasticidad mediada por NMDAR. Los cambios aberrantes en la activación de NMDAR y la síntesis y disponibilidad de d-serina se han implicado en la neuroinflamación y la excitotoxicidad en la enfermedad de Alzheimer, la esclerosis amiotrófica, la isquemia y la esquizofrenia44,78. Se ha sugerido que en ciertos estados patológicos la regulación de la d-serina es anormal y actualmente se están llevando a cabo ensayos clínicos dirigidos a la d-serina, así como a sus vías biosintéticas y reguladoras para uso terapéutico39,40. Comprender las vías de señalización y los mecanismos precisos por los cuales la d-serina afecta la estructura y la función proporcionará información importante sobre la plasticidad mediada por NMDAR dependiente de la experiencia tanto en la salud como en la enfermedad.

El código personalizado está disponible en Github para la dinámica de los filopodios dendríticos https://github.com/fieryzarzar/morphology_timecourse_analysis y para el mapeo retinotópico https://github.com/RuthazerLab/XenMap. El código para eliminar ruido de CANDLE se encuentra en https://sites.google.com/site/pierrickcoupe/softwares/denoising/multiphoton-image-filtering.

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Las imágenes confocales se realizaron en las instalaciones centrales de neuromicroscopía. Este trabajo fue financiado por una Chaire de recherche del Fonds de recherche du Québec—Santé (FRQS Grant 31036) y una Fundación Grant de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (CIHR FDN-143238) para ER y el Programa Integrado de Neurociencia de la Universidad McGill. Becas para ZC y VJL.

Instituto Neurológico de Montreal-Hospital y Departamento de Neurología y Neurocirugía, Universidad McGill, 3801 Rue University, Montreal, QC, H3A 2B4, Canadá

Zahra Chorghay, Vanessa J. Li, Anne Schohl y Edward S. Ruthazer

MILA, 6666 Rue St Urbain, Montreal, QC, H2S 3H1, Canadá

Arna Ghosh

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ZC y ESR conceptualizaron el trabajo y escribieron el manuscrito. ZC realizó y analizó experimentos para las figuras 1, 2 y 3, y VL realizó y analizó experimentos para la figura 4. AG ayudó a ZC con la codificación para el análisis de datos para la figura 2. AS generó construcciones experimentales y realizó experimentos para la figura 3E. y F, y brindó soporte técnico. ESR obtuvo financiación y supervisó la investigación.

Correspondencia a Edward S. Ruthazer.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Chorghay, Z., Li, VJ, Schohl, A. et al. Los efectos del coagonista de NMDAR, d-serina, sobre la estructura y función de las neuronas ópticas tectales en el sistema visual en desarrollo. Representante científico 13, 13383 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-39951-4

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Recibido: 27 de marzo de 2023

Aceptado: 02 de agosto de 2023

Publicado: 17 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-39951-4

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